杨 渊，等，桂林医科大学公共卫生学院同花财富，广西桂林，541199
【摘要】 目的 探讨香菇多糖（lentinan，LNT）对亚砷酸钠（sodium arsenite，SA）染毒小鼠肝组织铁死亡的干预效应与机制。方法 C57BL/6雄性小鼠经SA低剂量、高剂量染毒，以及LNT干预SA高剂量染毒后，苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色评价肝组织病理损伤；酶联免疫吸附法或免疫印迹法检测肝组织肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、铁自噬或铁死亡标志物含量或表达。结果 与对照组相比，SA染毒诱导小鼠肝组织TNFα和IL-6水平升高，铁自噬标志物铁蛋白重链（ferritin heavy chain 1，FTH1）和微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，MAP1LC3B）含量升高，铁死亡标志物谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）水平下调（P<0.05）；与SA高剂量组相比，LNT干预后显示肝组织病理损伤减轻，TNFα、IL-6、FTH1和MAP1LC3B水平下调，而GPX4水平上调（P<0.05）；免疫印迹实验显示，LNT干预拮抗SA高剂量组FTH1、自噬标记蛋白LC3B/A水平升高或拮抗FTH1与LC3B或泛素（ubiquitin，Ub）共表达（P<0.05）。结论 LNT拮抗SA染毒小鼠肝组织病理损伤和铁死亡，可能与TNFα-铁自噬信号抑制有关。
展开剩余85%【关键词】 亚砷酸钠；肝毒性；铁死亡；香菇多糖；铁自噬
环境化学污染毒物砷（arsenic，As）可通过污染土壤、饮用水或食物，对机体造成多器官毒性危害，其中肝是主要靶器官，研究显示砷暴露与肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、2型糖尿病等疾病发生密切相关[1]。既往研究发现，三氧化二砷染毒可诱导小鼠肝自噬水平升高、非酒精性脂肪性肝炎和肝细胞脂肪蓄积[2]。近来发现铁死亡、自噬与酒精诱导肝细胞脂质沉积[3]或高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝病发生发展密切相关[4]，线粒体融合蛋白-2介导铁死亡是砷暴露大鼠发生非酒精性脂肪性肝炎的病理机制[5]。本课题组前期实验证实LNT干预可改善SA暴露诱导的小鼠肝毒性或肝脂质蓄积，呈现出肝组织炎症相关肿瘤坏死因子受体超家族成员4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，OX40）降低特征[6-8]，OX40可诱导CD4+ T细胞分泌TNFα[9]，OX40水平升高与SA染毒小鼠肝组织TNFα水平上调及炎性损伤有关[10]。研究还发现，TNFα具有诱导人宫颈癌HeLa细胞自噬效应[11]，血清TNFα水平升高与高脂饮食诱导肥胖大鼠骨组织铁死亡发生密切相关[12]，但目前TNFα、铁自噬和铁死亡在砷染毒小鼠肝毒性中的作用机制不清楚。因此，本研究开展了SA染毒C57BL/6小鼠实验，应用LNT进行干预处理，检测肝组织TNFα信号、自噬和铁死亡特征，从炎症因子-自噬角度探讨LNT拮抗SA染毒小鼠肝组织铁死亡的作用机制。
结果：
1. LNT下调SA染毒小鼠血清ALT、AST和血清/肝TNFα水平
如图1所示，SA高剂量组或SA低剂量组与对照组相比，SA高剂量组或SA低剂量组显示血清ALT、AST、TNFα和肝组织TNFα水平升高（P<0.05）。SA高剂量组与SA低剂量组相比，SA高剂量组显示血清ALT、AST、TNFα和肝组织TNFα水平进一步升高（P<0.05）。LNT干预+SA高剂量组与SA高剂量组相比，LNT干预+SA高剂量组显示血清ALT、AST、TNFα和肝组织TNFα水平明显降低（P<0.05）。结果提示，LNT对SA诱导的肝功能损害和炎症效应产生拮抗效应。
图1. 血清ALT、AST、TNFα和肝TNFα水平特征
注：与对照组相比同花财富，*P<0.05；与SA低剂量或高剂量组相比，#P<0.05。
2. LNT拮抗SA染毒组Fe2+、MAP1LC3B、IL-6和GPX4水平
如图2所示，SA高剂量组或SA低剂量组与对照组相比，SA高剂量组或SA低剂量组显示肝组织Fe2+、IL-6和自噬标志物MAP1LC3B水平升高，而铁死亡标志物GPX4水平降低（P<0.05）。SA高剂量组与SA低剂量组相比，SA高剂量组显示肝组织水平Fe2+和IL-6进一步升高（P<0.05），而MAP1LC3B和GPX4水平变化无统计学意义（P>0.05）。LNT干预+SA高剂量组与SA高剂量组相比，Ⅳ组显示肝组织Fe2+、MAP1LC3B和IL-6水平降低，而GPX4水平升高（P<0.05）。结果提示SA低或高剂量染毒诱导小鼠肝组织炎症效应、铁自噬和铁死亡，LNT干预可对此产生拮抗效应。
图2. SA染毒或LNT干预后Fe2+、MAP1LC3B、IL-6和GPX4水平
注：与对照组相比，*P<0.05；与SA低剂量或高剂量组比较，#P<0.05。
.3. LNT下调SA染毒组FTH1、LC3B/A、FTH1-LC3和FTH1-Ub水平
肝组织WB和Co-IP实验结果显示（图3），SA低剂量组与对照组相比，SA低剂量组显示FTH1表达和LC3B/A比值升高，FTH1与LC3蛋白或FTH1与Ub蛋白共表达水平升高（P<0.05）。SA高剂量组与SA低剂量组相比，SA高剂量组FTH1、LC3B/A比值、FTH1-LC3和FTH1-Ub水平进一步升高（P<0.05）。LNT干预+SA高剂量组与SA高剂量组相比，LNT干预+SA高剂量组显示FTH1、LC3B/A比值、FTH1-LC3和FTH1-Ub水平降低（P<0.05）。结果提示，SA暴露诱导小鼠肝组织线粒体铁蛋白（mitochondrial ferritin，FTMT）表达上调及其介导的铁自噬，而LNT干预可抑制SA染毒小鼠FTMT表达和铁自噬。
图3. 肝组织FTH1、LC3B/A水平与FTH1-LC3B、FTH1-Ub共表达特征
上：WB实验结果；下：Co-IP实验结果
注：*与对照组相比，P<0.05；#与SA低剂量或高剂量组比较，P<0.05
3 讨论
铁死亡是一种近年来发现的体内铁超载介导脂质过氧化物和脂质活性氧（L-ROS）蓄积一种新型细胞死亡模式，其特征性表现是Fe2+水平升高和GPX4水平降低[14]。研究发现，铁死亡是砷、镉、铜等非铁金属/类金属的毒性特征，其潜在机制为线粒体功能障碍、线粒体活性氧（mt-ROS）释放，进一步诱发铁自噬和细胞铁死亡[15-16]。例如，砷染毒鸡肝细胞发生线粒体功能障碍和AMP活化蛋白激酶（AMPK）-Unc-51样激酶1（ULK1）自噬通路激活，诱导铁自噬介导肝细胞铁死亡[17]。目前认为，铁自噬是细胞铁超载及铁死亡发生的上游机制，当细胞内线粒体功能障碍发生后，受损的线粒体释放FTMT和核受体辅激活因子4（NCOA4）构成复合物并与自噬体融合，可靶向溶酶体降解FTMT而释放出游离铁，从而诱发铁超载、铁自噬及铁死亡发生[18]。在本次研究中，我们发现SA低剂量或高剂量染毒组小鼠肝组织自噬标志物MAP1LC3B升高而铁死亡标志物GPX4水平降低，提示肝组织发生自噬和铁死亡。进一步发现，肝组织Fe2+和炎症因子TNFα、IL-6水平呈SA低剂量→高剂量升高的正向剂量-效应关系，且肝组织FTH1表达、LC3B/A比值、FTH1-LC3和FTH1-Ub共表达亦呈随剂量增加而增加的升高趋势。而且，ZDOCK分子对接实验亦显示FTMT具有结合自噬相关蛋白LC3和泛素蛋白Ub的生物学活性。结果提示SA诱导小鼠肝组织细胞发生剂量依赖的炎症和铁自噬激活，导致肝细胞铁死亡。
食用菌香菇属于蘑菇科真菌类植物，具有较高的营养和药用价值，其富含的LNT是一种以β-1，6；1，3-葡聚糖结构为主链的活性多糖，具有较高的抗氧化能力[19]和免疫调节活性[20]。本课题组前期发现LNT具有抑制砷染毒小鼠肝组织炎症因子IL-17A或IL-1β水平和拮抗肝脂质蓄积效应[6-7]。本研究发现，LNT干预可降低砷染毒小鼠肝组织炎症因子TNFα/IL-6水平，相应的，铁自噬标志物FTH1、LC3B/A水平亦降低，而铁死亡标志物水平GPX4升高，结果提示LNT可能通过抑制炎症因子TNFα/IL-6相关的铁自噬通路，对砷染毒小鼠肝组织铁死亡产生拮抗效应。
自噬是真核生物细胞维持内环境稳态的保守机制，自噬过程主要依赖于溶酶体对受损的细胞结构或线粒体等启动泛素化-蛋白酶体水解的自我降解过程，可分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬三种形式[21]。TNFα是一种由活化的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞多效炎症因子，具有诱导炎症、自噬和细胞凋亡效应[11]。研究发现，过表达TNFα可通过肿瘤坏死因子受体1（TNF receptor 1，TNFR1）信号介导促炎症因子IL-6和TNF相关促凋亡配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）上调，诱导细胞线粒体功能障碍、自噬水平上调和早期细胞凋亡[22]。研究还发现，内皮细胞炎症因子TNFα/IL-6上调与铁自噬激活和铁死亡有关[23]。而动物实验亦证实，饮水亚砷酸钠暴露通过激活铁自噬诱导C57BL/6J雄性小鼠神经细胞铁死亡[24]。在本次研究中，我们发现LNT干预后小鼠肝组织炎症因子TNFα和IL-6水平降低，Fe2+、FTH1、LC3B/A比值以及FTH1-LC3和FTH1-Ub共表达水平亦降低，因此推测LNT可能通过抑制肝组织TNFα/IL-6炎症信号，进而拮抗肝细胞线粒体损伤相关的铁自噬通路，从而改善肝组织细胞铁死亡。由于本次研究仅从体内实验发现香菇多糖抑制TNFα-铁自噬和拮抗SA染毒小鼠肝组织细胞铁死亡，体外实验的相应证据尚显不足，在未来的工作中应增加体外肝细胞SA染毒及LNT干预模型，通过铁自噬或铁死亡靶向干预，进一步从炎症-铁自噬角度探索LNT改善砷诱导肝毒性的生物学机制。
参考文献：略同花财富
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